MALDI-TOF MS

RIPAC-LABOR gebruikt verschillende diagnostische technieken voor het identificeren van micro-organismen. De MALDI-TOF MS is er hier één van, maar ook agglutinatie, sneltesten en PCR worden toegepast.
De MALDI-TOF MS is een methode die gebruikt wordt in verschillende humane en veterinaire diagnostische laboratoria, en in laboratoria die bacteriologisch onderzoek van omgevingsmonsters doen. Er zijn wereldwijd ongeveer 3.000 apparaten geïnstalleerd. In dit artikel willen we informatie met u delen over het werkingsmechanisme van deze techniek, als ook over de mogelijkheden van deze test.

De techniek

MALDI-TOF MS is een afkorting van Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry. Deze techniek is gebaseerd op een automatische analyse van de massaverdeling van eiwitten afkomstig van bacteriën of schimmels.
De monsters worden in het apparaat in een hoogvacuümomgeving gebracht. De spectrometer bevat een zeer nauwkeurige laser. Deze laser ioniseert het monster. Daarna komt er een “wolk” van ionen vrij die versneld wordt door een elektrische lading. Deze ionen passeren een ringelektrode. De MALDI-TOF MS determineert vervolgens de Time of Flight, gebaseerd op een formule is afgeleid van de tijd die het ion nodig heeft om de detectieplaat te bereiken. Tot slot worden de eiwitten gedetecteerd met een sensor om een spectrum te creëren met het aantal ionen en hun specifieke massa.

Figuur 1 Het MALDI-TOF MS werkingsmechanisme (Patel, 2014)

Het spectrum

Als het spectrum vergeleken wordt met de database, wordt bekend wat de uitslag is. Het spectrum is namelijk uniek voor een bepaalde bacterie. Meestal kan een monster geïdentificeerd worden tot op het niveau van de species of subspecies. Soms kan ook het serotype bepaald worden.

Hieronder wordt een voorbeeld gegeven van een spectrum, in dit geval voor Riemerella anatipestifer. De pieken die geel zijn gemarkeerd zijn specifiek voor de familie, de groen gemarkeerde pieken voor het genus en de rood gemarkeerde pieken voor de species.

Figuur 2 MALDI-TOF MS Spectrum (RIPAC-LABOR)

RIPAC-LABOR maakt gebruik van de VITEK® MS ROU, die door BioMerieux op de markt wordt gebracht. Dit apparaat heeft een open database. RIPAC-LABOR gebruikt de commerciële database met ongeveer 20.000 referentiespectra. Daarnaast beschikt RIPAC-LABOR over nog 20.000 eigen referentiespectra met minder vaak voorkomende species, die door de jaren heen zijn opgebouwd.

Mogelijkheden

De MALDI-TOF MS is een eenvoudige, snelle en gevoelige methode voor de identificatie van groeiende bacteriën en schimmels. Zowel aërobe als anaërobe bacteriën kunnen geïdentificeerd worden. De gebruikte database bevat de meest voorkomende bacteriële stammen die geïsoleerd worden bij pluimvee, varkens en runderen. Daarnaast worden alle referentie spectra opgeslagen, ook van onbekende stammen. Deze spectra worden met elkaar vergeleken, waardoor RIPAC-LABOR een uitbraak met een nieuwe pathogeen snel zal signaleren.

Daarnaast is het ook mogelijk om mengculturen te identificeren, bestaande uit maximaal drie verschillende bacteriën.

Het bepalen van de antibioticumgevoeligheid wordt niet standaard gedaan met de MALDI-TOF MS. Hiervoor wordt doorgaans een antibiogram gemaakt. Sommige factoren die geassocieerd worden met resistentie, zoals β-lactamases en MRSA, zijn echter eiwitten. En deze eiwitten kunnen gedetecteerd worden met de MALDI-TOF MS. Voordat deze eiwitten aangetoond kunnen worden in de MALDI-TOF MS, wordt de bacterie tijdens de kweek blootgesteld aan antibiotica, zodat de bacterie aangezet wordt tot het produceren van de resistentiefactoren. Ondanks dat het mogelijk is om resistentiefactoren te bepalen met de MALDI-TOF MS, is het niet eenvoudig. Er zijn namelijk erg veel β-lactamase moleculen met verschillende massa’s. Bovendien lijken deze massa’s soms veel op de massa’s van andere bacteriële eiwitten.

Monsters

Om de MALDI-TOF MS uit te kunnen voeren is een groeiende bacteriestam nodig. Dit betekent dat de bacteriën eerst geïsoleerd moeten worden uit het karkas, of uit een ander monster (bijv. bloed, faeces, melk). Daarna kunnen deze stammen gekweekt worden. Van de plaat wordt een kolonie gepakt en op een MALDI-TOF MS plaat geplaatst. Hier wordt de kolonie gemengd met 1 µl van een matrixoplossing. Het toevoegen van de stammen aan de matrix zorgt voor extractie van de moleculen uit de cellen, wat leidt tot kristalvorming. Deze plaat wordt in de ionisatie kamer van de massaspectrometer geplaatst. De rest van het proces is geautomatiseerd, waardoor de monsters snel geanalyseerd kunnen worden.

RIPAC-LABOR

RIPAC-LABOR werkt al meer dan 10 jaar met de MALDI-TOF MS. De laboranten van RIPAC-LABOR gebruiken deze techniek voor de identificatie van verschillende micro-organismen waaronder bacteriën, schimmels en gisten. Daarnaast wordt de MALDI-TOF MS gebruikt voor het detecteren van natuurlijke producten van bacteriën en schimmels. Voorbeelden van deze natuurlijke producten zijn delta toxines van Staphylococcus aureus of niet-ribosomale eiwitten van Bacillus spp.

Tot slot kan deze techniek ook gebruikt worden voor de detectie van synthetische producten, zoals polymeren.

Bij RIPAC-LABOR wordt de MALDI-TOF MS gebruikt voor de analyse van verschillende soorten monsters:

• klinische veterinaire monsters;
• klinische humane monsters;
• omgevingsmonsters;
• monsters van biogasinstallaties.

Omdat RIPAC-LABOR al een jarenlange ervaring heeft met de MALDI-TOF MS, hebben ze een grote hoeveelheid referentie spectra in de database. Dit betekent dat RIPAC-LABOR ook veel veterinaire bacteriën in de database heeft, waardoor ze goed in staat zijn om veterinair belangrijke bacteriën snel en nauwkeurig te bepalen. Ook nieuwe en minder bekende pathogenen, die met de klassieke biochemische testen niet geïdentificeerd kunnen worden, kunnen met de MALDI-TOF MS soms wel geïdentificeerd worden.Bij RIPAC-LABOR wordt de MALDI-TOF MS vooral gebruikt voor de identificatie van stammen die gebruikt worden voor de productie van bedrijfsspecifieke vaccins.

Praktische informatie

Indien u gebruik wenst te maken van de diagnostische mogelijkheden van RIPAC-LABOR, kunt u altijd contact opnemen met het Technical Support Team. Het inzendformulier voor diagnostiek staat op de pagina bestelformulieren.

Referenties

1. Belkum, A. van, Welker, M., Erhard, M., Chatellier, S. (2012) Biomedical mass spectrometry in today’s and tomorrow’s clinical microbiology laboratories. J Clin Microbiol. 2012 May: 50(5): 1513-7.
2. Jung, J.S., Popp, C., Sparbier, K. Lange, C., Kostrzwa, M., Schubert, S. (2014) Evaluation of MALDI-TOF MS for rapid detection of β-lactam resistance in Enterobacteriae derived from blood cultures. J. Clin. Microbopl. 52(3):924-30.
3. Patel, R. (2015) MALDI-TOF MS for the diagnosis of infectious disease. Clinical chemistry 61:1 (100-111).
4. Singhal, N., Kumar, M., Kanaulja, P., Virdl, J. S. (2015) MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis. Frontiers in microbiology 6:791.
5. Vitek MS website.